Unión a receptores: Kd, ligando libre e cantidade

Unha célula pode ter máis receptores ca outra sen que cada receptor una o ligando con maior afinidade. Tamén pode recibir unha cantidade total de ligando que non coincida coa concentración que queda libre. Confundir estas magnitudes produce respostas incorrectas mesmo cando a fórmula de ocupación está ben memorizada.

Esta práctica introduce un modelo sinxelo de unión reversible mediante tres exercicios orixinais. É unha ampliación conceptual, sen interpretación clínica nin instrucións experimentais. Non atribúe a unha convocatoria a necesidade de estudar este modelo.

Un modelo de equilibrio con sitios equivalentes

Representamos a unión como R + L ⇌ RL. R é receptor libre; L, ligando libre; RL, complexo unido. Supoñemos un único tipo de sitio, unión un a un, ausencia de cooperatividade e equilibrio nas condicións do problema.

A constante de disociación é Kd = [R]·[L]/[RL]. Se Rt é a concentración total de sitios e B a de complexos, a ocupación é θ = B/Rt = [L]/(Kd+[L]).

As unidades de Kd son de concentración. O ligando que aparece na fórmula é libre, non automaticamente o total engadido. No modelo, θ vale un medio cando [L] libre coincide con Kd.

A revisión académica de Hulme e Birdsall sobre unión de ligandos en equilibrio explica estes conceptos e as dificultades cando se esgota unha parte apreciable do ligando libre. Aquí empregamos a introdución e a teoría pertinente de unión e saturación, con datos propios.

Caso 1: ocupación e cantidade unida non son o mesmo número

Unha mostra ten Kd = 6 nM e unha cantidade total de 80 fmol de sitios. O problema proporciona directamente concentracións de ligando libre de 2, 6 e 18 nM. Calcula a fracción ocupada e a cantidade unida en cada condición.

Con 2 nM, θ = 2/(6+2) = 0,25. A cantidade unida é 0,25·80 = 20 fmol.

Con 6 nM, θ = 6/(6+6) = 0,50. Hai 40 fmol unidos. Este punto comproba o significado de Kd no modelo.

Con 18 nM, θ = 18/(6+18) = 0,75. Hai 60 fmol unidos. Triplicar a concentración respecto de Kd non produce un 150 % de ocupación: a función non é unha proporcionalidade directa.

As concentracións libres están dadas. Non precisamos deducilas a partir do que se engadiu inicialmente. A cantidade unida e a concentración libre teñen unidades distintas; calculamos a primeira multiplicando unha fracción pola cantidade de sitios.

Aumentar a concentración libre leva a unha ocupación máis alta, pero θ non supera un baixo estas hipóteses. O límite representa todos os sitios ocupados, non unha concentración infinita de receptores.

Caso 2: máis sitios sen cambiar Kd

Dúas mostras A e B teñen o mesmo tipo de receptor e Kd = 6 nM. A contén 80 fmol de sitios; B contén 160 fmol. En ambas mantense unha concentración libre de ligando de 6 nM.

A ocupación é 0,50 nas dúas. A cantidade unida é 40 fmol en A e 80 fmol en B.

B une o dobre porque ten o dobre de sitios dispoñibles. Non deducimos maior afinidade: Kd e a ocupación á mesma concentración libre son iguais por definición do problema.

O mantemento da mesma concentración libre é unha condición importante. Se só engadísemos a mesma cantidade total a recipientes distintos, unha mostra podería retirar máis ligando da fase libre. Non poderiamos conservar [L] sen comprobalo.

Agora preguntamos que concentración libre produce unha ocupación do 80 %. Resolvemos 0,80 = L/(6+L). Multiplicando: 4,8+0,80L=L, de onde L = 24 nM.

O resultado non depende da cantidade total de sitios neste modelo cando a concentración libre está fixada. Si cambia a cantidade unida: 64 fmol en A e 128 fmol en B. Mantemos separadas fracción, cantidade e concentración.

Este cálculo non proporciona unha dose nin predí unha resposta fisiolóxica. Só describe unha unión de equilibrio baixo hipóteses declaradas.

Caso 3: o ligando total inclúe o que xa está unido

Nun recipiente ideal, Rt = 10 nM e Kd = 10 nM. Medimos B = 5 nM de complexo en equilibrio. Non hai outros lugares de unión nin perdas. Calcula ligando libre e total.

A ocupación é B/Rt = 5/10 = 0,50. Polo tanto, o ligando libre é 10 nM, igual a Kd.

O balance de ligando é Ltotal = Llibre + B. Obtemos 15 nM totais: 10 libres e 5 unidos. As dúas cantidades suman porque aquí ambas se expresan como concentración no mesmo volume.

Se substituísemos o total na fórmula como se fose libre, obteríamos θ = 15/(10+15) = 0,60, incompatible co 0,50 medido. A diferenza non se resolve cambiando arbitrariamente Kd: utilizamos a variable equivocada.

Tamén podemos comprobar a constante coa concentración de receptor libre. R = Rt−B = 5 nM. Entón Kd = 5·10/5 = 10 nM, como debía ocorrer.

Este exercicio identifica unha diferenza respecto dos dous anteriores: alí coñeciamos directamente a concentración libre; aquí reconstruímola cun balance. Non hai que supoñer que total e libre sexan sempre intercambiables.

Ocupación non equivale a efecto

Un ensaio de unión mide complexos ou ocupación, non necesariamente a resposta posterior da célula. Dúas condicións coa mesma ocupación poden diferir noutros procesos. O modelo non determina unha relación universal entre porcentaxe unida e intensidade do efecto.

O exercicio de cinética encimática utiliza Km e velocidade inicial. Aquí Kd describe un equilibrio de unión: non identificamos automaticamente Km e Kd, aínda que dúas expresións matemáticas teñan unha forma parecida.

Do mesmo xeito, esta práctica non trata a hemoglobina como un receptor non cooperativo. A forma do modelo e as súas hipóteses deben corresponder ao sistema que declara cada problema.

Preguntas frecuentes

A concentración total de ligando pode substituír sempre á libre?

Non. O ligando unido forma parte do total. Se a unión retira unha fracción apreciable, usar o total como libre altera o cálculo.

Duplicar os receptores demostra maior afinidade?

Non. Pode duplicar a cantidade unida á mesma ocupación sen cambiar Kd. Número de sitios e afinidade son propiedades diferentes.

Un 50 % de ocupación implica un 50 % de resposta celular?

Non neste modelo. A ecuación describe unión de equilibrio e non proporciona unha relación universal coa resposta posterior.

Comproba o balance antes de interpretar a curva

Tapa o resultado do terceiro caso e reconstrúe os tres grupos: ligando libre, complexo e receptor libre. Garda o balance na libreta de erros. A ficha de Bioloxía de Galicia permite revisar contidos e condicións actuais de compra para continuar o estudo.