Electroforese de ADN: bandas, tamaño e cantidade

Unha banda de ADN nun xel non é unha fotografía dun único fragmento. Pode representar moitas moléculas cunha migración semellante, e varios fragmentos do mesmo tamaño poden quedar na mesma posición. Para interpretar o resultado necesitamos separar tamaño, número de bandas e cantidade de ADN.

Esta práctica usa tres diagramas descritos mediante datos ficticios. Non propón executar un procedemento de laboratorio nin identificar persoas. O obxectivo é ler unha separación de fragmentos lineais de ADN bicatenario baixo condicións comparables e xustificar ata onde chega a información.

Define o modelo de separación antes de contar

No modelo de electroforese empregado aquí, o ADN ten carga neta negativa e migra cara ao eléctrodo positivo. Nun mesmo xel, os fragmentos lineais máis pequenos adoitan avanzar máis que os grandes. A comparación faise cun patrón de tamaños coñecidos, non transformando calquera distancia nun tamaño por unha regra universal.

O apartado de biotecnoloxía de OpenStax permite contrastar a separación por tamaño e o uso dunha referencia. As táboas e as contas seguintes son orixinais.

Limitamos o modelo a fragmentos lineais da mesma natureza. Moléculas circulares con distintas conformacións poden migrar de maneira diferente; non aplicamos automaticamente esta interpretación a plasmidios sen cortar. Tampouco comparamos distancias de xeles con condicións distintas coma se fosen equivalentes.

A palabra banda describe unha zona do resultado. Non significa por si soa unha molécula, un xene ou unha especie. Cada unha desas conclusións necesitaría información adicional.

Caso 1: ordenar tamaños cun patrón no mesmo xel

Un patrón ten tres bandas: 1200 pares de bases avanzan 18 mm; 800 pares avanzan 27 mm; 400 pares avanzan 39 mm. Nunha mostra, a banda X coincide coa referencia de 800 pares e a banda Y coincide coa de 400.

Baixo o modelo do exercicio asignamos X a aproximadamente 800 pares de bases e Y a aproximadamente 400. Y avanzou máis e corresponde ao fragmento menor. Non invertimos a orde pensando que unha molécula maior debe avanzar máis por ter máis carga: a separación no xel tamén depende do paso pola súa matriz.

Unha terceira banda Z queda entre as referencias de 800 e 400. Só con esa descrición podemos situar o seu tamaño entre 400 e 800 pares baixo a relación monótona suposta. Non podemos afirmar que mide exactamente 600.

O punto medio da distancia non implica o punto medio aritmético dos tamaños. Para unha estimación máis precisa faría falta unha calibración adecuada, con máis datos e a relación correspondente. Non introducimos unha interpolación lineal sen que o enunciado a autorice.

A coincidencia dunha banda co patrón tampouco demostra que a súa secuencia sexa a mesma ca a da referencia. Dous fragmentos poden ter a mesma lonxitude e diferente orde de bases.

Caso 2: tres fragmentos poden producir só dúas bandas

Unha mostra está formada, segundo información independente, por tres fragmentos lineais: 900, 450 e 450 pares de bases. Todos migran no mesmo xel baixo condicións que separan eses tamaños, pero non distinguen secuencias da mesma lonxitude.

Cantas posicións de banda esperamos? Dúas: unha correspondente a 900 e outra a 450. Os dous fragmentos de 450 poden coincidir na mesma zona.

Cantos fragmentos hai no conxunto descrito? Tres. O dato procede da composición que fornece o enunciado, non de contar dúas bandas. Esta distinción impide usar o número de bandas como reconto universal de fragmentos diferentes.

A suma das lonxitudes é 900 + 450 + 450 = 1800 pares de bases. Se o exercicio fixa que proceden dunha única molécula lineal cortada completamente, sen perdas nin outros fragmentos, esa sería a lonxitude inicial baixo eses supostos.

Non podemos deducir só da imaxe que se realizou unha dixestión completa. Tampouco sabemos a orde dos fragmentos na molécula inicial a partir das dúas posicións. A separación por tamaño non reconstrúe automaticamente un mapa.

Se cada molécula inicial produce unha copia de cada fragmento, a banda de 450 reúne dous fragmentos por molécula inicial e a de 900 reúne un. Pero a masa total correspondente sería 450 + 450 = 900 na primeira posición e 900 na segunda. Polo tanto, non deberiamos afirmar que a banda de 450 ten o dobre de masa só porque contén dous fragmentos.

Caso 3: intensidade, masa e número de moléculas

Nun modelo cuantitativo ficticio, o sinal dunha banda é proporcional á masa de ADN que contén e a detección está dentro do intervalo lineal. Dúas bandas teñen o mesmo sinal: unha corresponde a fragmentos de 300 pares de bases e outra a fragmentos de 900.

O mesmo sinal implica a mesma masa baixo o suposto declarado. Como cada fragmento de 900 ten aproximadamente tres veces a masa dun de 300 da mesma natureza química, a banda de 300 contén aproximadamente tres veces máis moléculas.

A relación é N300·300 = N900·900. Ao dividir, N300/N900 = 900/300 = 3.

Se a banda de 900 tivese 2 unidades de sinal e a de 300 tivese 4, a razón de masas sería 2 a 1 a favor da banda de 300. A razón de moléculas sería 2·900/300 = 6. O tamaño e a intensidade deben combinarse; ningún dos dous datos substitúe o outro.

Nun resultado real, a proporcionalidade pode fallar por saturación, fondo ou diferenzas de detección. Por iso o exercicio declara expresamente o modelo e non presenta a conta como un reconto exacto aplicable a calquera fotografía.

Separa o observado do que se proporciona como hipótese

Escribe tres columnas no teu caderno: posición, tamaño estimado e cantidade inferida. A posición é unha observación; o tamaño depende da referencia e do modelo; a cantidade require un suposto adicional sobre o sinal.

Non confundas esta tarefa co cálculo do número de fragmentos que produce unha determinada lista de cortes. Esa outra cuestión precisa coñecer a molécula e as posicións de corte. Aquí partimos dun resultado de separación e examinamos os límites da súa lectura.

A guía xeral de microbioloxía e biotecnoloxía sitúa a técnica dentro do bloque. Estes casos non repiten un exercicio de amplificación por PCR: aumentar copias e separar por tamaño son operacións distintas.

Preguntas frecuentes

Unha banda significa sempre un único fragmento?

Non. Moitas moléculas e varios fragmentos da mesma lonxitude poden coincidir na mesma posición baixo o modelo de separación.

Unha banda máis afastada corresponde aquí a ADN máis grande?

Non. Nos fragmentos lineais comparables do exercicio, os máis pequenos avanzan máis dentro do mesmo xel.

A mesma intensidade implica o mesmo número de moléculas?

Non necesariamente. Se o sinal é proporcional á masa, hai que considerar tamén a lonxitude dos fragmentos para comparar números de moléculas.

Conta bandas sen perder a información do tamaño

Repite o segundo caso con fragmentos de 1000, 500 e 500 pares de bases. Xustifica por que seguen aparecendo dúas posicións e por que a suma conserva tres fragmentos. Garda a distinción na libreta de erros e consulta a ficha de Bioloxía de Galicia para ver contidos, prezo e condicións actuais de compra. Son problemas orixinais; contrasta o programa da túa comunidade antes de atribuírlles carácter oficial.